Q：親和層析定義：

A：生(shēng)物分(fēn)子(zǐ)間存在很多特異性的相互作(zuò)用，如(rú)我們熟悉的抗原－抗體、酶－底物或抑制劑、激素－受體等等，它們之間都能(néng)夠專一(yī)而可逆的結合，這種結合力就(jiù)稱爲親和力。親和層析的分(fēn)離原理(lǐ)簡單的說就(jiù)是通過将具有親和力的兩個分(fēn)子(zǐ)中一(yī)個固定在不溶性基質上(shàng)，利用分(fēn)子(zǐ)間親和力的特異性和可逆性，對另一(yī)個分(fēn)子(zǐ)進行分(fēn)離純化(huà)。被固定在基質上(shàng)的分(fēn)子(zǐ)稱爲配體，配體和基質是共價結合的，構成親和層析的固定相，稱爲親和吸附劑。親和層析時首先選擇與待分(fēn)離的生(shēng)物大分(fēn)子(zǐ)有親和力物質作(zuò)爲配體，例如(rú)分(fēn)離酶可以選擇其底物類似物或競争性抑制劑爲配體，分(fēn)離抗體可以選擇抗原作(zuò)爲配體等等。不同生(shēng)物對之間結合的特異性盡管存在高低(dī)差異，但(dàn)它們之問都能(néng)夠可逆地結合和解離，可由此進行蛋白質、多糖、核酸或細胞的分(fēn)離和純化(huà)。

Q：凝膠過濾層析定義：

A：凝膠過濾介質都是具有三維網狀結構的顆粒，當顆粒狀介質填充成層析柱時，在顆粒間存在大量間隙，隻有直徑小于顆粒網孔孔徑的分(fēn)子(zǐ)能(néng)夠進入凝膠顆粒内部，無法進入凝膠顆粒内部的分(fēn)子(zǐ)将從間隙中通過。因此，凝膠過濾分(fēn)離的原理(lǐ)可簡單認爲是不同的溶質因不同程度進入介質而在液相中停留的時間不同，凝膠的孔徑和溶質分(fēn)子(zǐ)大小的關系決定了(le)層析時該物質在層析柱中的保留時間，不同的物質因保留時間不同而分(fēn)離。

Q：離子(zǐ)交換層析定義：

A：待分(fēn)離物質在特定條件下(xià)與離子(zǐ)交換劑帶相反電荷因而能(néng)夠與之競争結合，而不同的分(fēn)子(zǐ)在此條件下(xià)帶電荷的種類、數量及電荷的分(fēn)布不同，表現出與離子(zǐ)交換劑在結合強度上(shàng)的差異，在離子(zǐ)交換層析時按結合力由弱到強的順序被洗脫下(xià)來而得以分(fēn)離。蛋白質、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他帶電生(shēng)物分(fēn)子(zǐ)正是如(rú)此通過離子(zǐ)交換劑得到了(le)分(fēn)離純化(huà)，即帶負電荷的溶質可被陰離子(zǐ)交換劑交換，帶正電荷的溶質可被陽離子(zǐ)交換劑交換。

Q：疏水層析定義：

A：蛋白質和多肽等生(shēng)物大分(fēn)子(zǐ)的表面常常暴露着一(yī)些(xiē)疏水性基團，疏水性基團可以與疏水性層析介質發生(shēng)疏水性相互作(zuò)用而結合。不同的分(fēn)子(zǐ)由于疏水性不同，它們與疏水性層析介質之間的疏水性作(zuò)用力強弱不同，溶液中的高離子(zǐ)強度可以增強蛋白質或多肽等生(shēng)物大分(fēn)子(zǐ)與疏水性層析介質之間的疏水作(zuò)用。利用這個性質，在高離子(zǐ)強度下(xià)将待分(fēn)離的樣品吸附在疏水性層析介質上(shàng)，然後通過線性或階段降低(dī)離子(zǐ)強度選擇性的将樣品解吸。疏水性弱的物質，在較高離子(zǐ)強度的溶液時被洗脫下(xià)來，當離子(zǐ)強度降低(dī)時，疏水性強的物質才随後被洗脫下(xià)來。

Q：如(rú)何判斷填料壽命已經到了(le)？

A：當發現填料在經過CIP、再生(shēng)後，不能(néng)使填料恢複原本的顔色、緩沖液流經速度明顯下(xià)降、樣品挂柱效果出現一(yī)定程度下(xià)降，或者純化(huà)出的樣品純度開始下(xià)降時，就(jiù)要更換填料了(le)。爲提高填料使用壽命，請在上(shàng)樣前務必對填料進行澄清處理(lǐ)，并在使用結束後及時CIP并采用推薦的儲存條件進行儲存。

Q：Ni 柱進行蛋白純化(huà)需要注意什(shén)麽?

A：緩沖液中不能(néng)有高濃度的電子(zǐ)供體基團、不能(néng)有強螯合劑、不能(néng)有高濃度強還原劑、不能(néng)含離子(zǐ)型去垢劑、避免含碳酸氫鈉等物質。

Q：GST 蛋白純化(huà)需要注意什(shén)麽？

A：避免蛋白樣品超聲太劇烈或時間過長引起的蛋白變性，增加洗脫緩沖液的 pH 值可在不增加還原谷胱甘肽濃度的情況下(xià)提高洗脫效率。

Q：抗體純化(huà)時需要注意什(shén)麽？

A：(1)介質的選擇A,G or 其他，其結合能(néng)力的選擇；(2)上(shàng)樣流速盡量小（一(yī)般保留時間爲4-6min爲宜），讓Protein A和抗體有充分(fēn)的結合時間；(3)在低(dī)pH值洗脫後，快(kuài)速中和；(4)長時間保存樣品加入0.02-0.05％疊氮鈉；(5)加入10%甘油，可有效防止疏水作(zuò)用引起的聚集；(6)抗體純度不夠，雜蛋白含量高，易引起蛋白的沉澱。。

Q：層析柱填料體積的計算(suàn)公式？

A：層析柱的底面積*高。

Q：瓊脂糖磁珠中氧化(huà)鐵的直徑是多少？

A：約400-500nm。

Q：連接抗體的瓊脂糖磁珠相較于直接連接抗體的磁珠有何優勢？

A：瓊脂糖基質具有非常好(hǎo)(hǎo)的親水性和載量，非特異性吸附作(zuò)用極低(dī)，并且可以通過磁吸分(fēn)離純化(huà)微量蛋白。

Q：純化(huà)蛋白時所需的緩沖液PB代表什(shén)麽？

A：鈉的磷酸鹽，按照一(yī)定的比例配置成不同pH的溶液。

Q：預活化(huà)介質爲什(shén)麽要在100%有機溶劑中低(dī)溫保存？

A：低(dī)溫的目的是爲了(le)防止活化(huà)基團降解；預活化(huà)層析介質的配基比較活潑，不能(néng)長時間接觸水否則會分(fēn)解，所以選擇100%有機溶劑中保存（一(yī)般情況保存在異丙醇、丙酮中）。

Q：強離子(zǐ)交換與弱離子(zǐ)交換有什(shén)麽差别？

A：強離子(zǐ)交換與弱離子(zǐ)交換的差異在于強的爲完全電離，弱的爲部分(fēn)電離。強的在較寬的 pH 範圍内有着比較好(hǎo)(hǎo)的載量，而弱的會随 pH 的不同結合的強度與載量有改變，所以，能(néng)提供更多的選擇性。一(yī)般推薦先嘗試強離子(zǐ)交換，在選擇性不好(hǎo)(hǎo)的時候可以再嘗試弱離子(zǐ)交換。

Q：關于 NHS 和 CNBr 的選擇？

A：CNBr 與 NHS 預活化(huà)填料最主要的區别是：NHS 預活化(huà)填料的反應位點與填料基架之間有 10或 14個原子(zǐ)的間隔臂，而 CNBr 則沒有。對于小分(fēn)子(zǐ)配基（< 5 KD），當配基和樣品結合的時候，由于 CNBr 沒有間隔臂，可能(néng)會由于空間位阻而影響結合，在這種情況下(xià)，建議使用 NHS 活化(huà)配基填料。對于大于 5KD 的配基，二者差異不大。

Q：不同樣品檢測的吸光度值？

A：蛋白樣品最大吸收值一(yī)般在 280 nm，核酸或病毒在 254 nm 或 260 nm；多肽 215 nm；多糖 206 nm。

Q：柱子(zǐ)有色素如(rú)何去除？

A：色素性質很複雜，可以根據填料的耐受情況，優先嘗試 NaOH 清洗，另外，也(yě)可以使用有機溶劑（如(rú) 30% 異丙醇或乙醇），最後再嘗試酸，如(rú) 0.01 M HCl。如(rú)果去除不掉，可以定期把色素污染部分(fēn)的填料去除。

Q：柱高不變，直徑由1.6cm放(fàng)大到比如(rú)20cm，柱壓會增大多少？

A：層析放(fàng)大的原理(lǐ)爲直徑放(fàng)大，柱高不變（即線性流速或保留時間不變）。在放(fàng)大時層析柱的分(fēn)配器(qì)，以及篩闆設計非常重要。設計優異的層析柱柱壓一(yī)般不會增大。

Q：Protein A和Protein G兩種介質在純化(huà)抗體有何區别，結合位點各有幾個？

A：protein G 的結合位點：Protein G與Ig G的Fc結合，同時也(yě)可以結合IgG CH1區域。此配基爲 17KD， PI 4.1. 在全抗體或Fc融合蛋白的純化(huà)中由于Protein A 層析介質的載量高于Protein G，所以一(yī)般使用Protein A層析介質。ProteinＡ的結合位點：與IgG結合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4。Protein A與抗體IgG 結合有兩個區域,Fc 與Fab。主要與Fc的CH2,CH3 結合的是Protein A 的B，與Fab 結合位點是VH3。

Q：線性洗脫會有什(shén)麽樣的問題？

A：線性洗脫較好(hǎo)(hǎo)的分(fēn)離方法，優點：高分(fēn)辨率；缺點：樣品濃度相對低(dī)，操作(zuò)時間長，需要雙泵系統。步梯度洗脫，優點：操作(zuò)時間短，樣品濃度高，但(dàn)是分(fēn)辨率低(dī)。

Q：抗體的等電點能(néng)否用生(shēng)物信息學的方法預測，消光系數怎麽計算(suàn)？

A：一(yī)般預測的軟件得到的一(yī)些(xiē)參數不是很準确，不同的表達系統，不同的培養方法，所得到的等電點不同。所以隻能(néng)參考。

Q：蛋白質聚集在柱子(zǐ)上(shàng)？

A：通過調整層析過程中的緩沖液來增加蛋白質的穩定性，改善蛋白質在層析柱上(shàng)的狀态。當堆積在層析柱上(shàng)時，需要用CIP清洗層析柱。

Q：結合緩沖液不合适，柱子(zǐ)平衡不好(hǎo)(hǎo)？

A：調整緩沖液，例如(rú)金(jīn)屬螯合介質與His-tagged蛋白結合時，pH值應在7.3-8.5之間。肝素親和介質與DNA聚合酶結合時，鹽濃度過高影響結合，應控制在50mM以下(xià)。色譜柱平衡不好(hǎo)(hǎo)。柱床系統中的環境也(yě)會影響結合。色譜柱在上(shàng)樣前必須完全平衡。

Q：如(rú)何去除樣品中的 DNA/RNA等核酸雜質污染？

A：延長超聲時間以降低(dī)粘度。也(yě)可以使用核酸酶如(rú) Benzonase同時消化(huà) DNA和 RNA。如(rú)果來源是大腸杆菌裂解液，含有大量的DNA，可以用鏈黴素沉澱等方法，預先去除大量的 DNA。

通過層析方法去除 ：由于核酸帶負電，在陰離子(zǐ)柱上(shàng)會結合或陽離子(zǐ)柱上(shàng)流穿，也(yě)可以有效去除核酸。去除填料上(shàng)結合的核酸 ：一(yī)般采用 1M NaOH + 1M NaCl對核酸的去除效果較好(hǎo)(hǎo)(需要确認填料是否可耐受NaOH)。如(rú)果核酸的吸附過強，會采用強烈的方法，3M氯化(huà)鈉去除靠靜電吸附的核酸，然後用 1M的氫氧化(huà)鈉分(fēn)解核酸，之後再用 3M NaCl清洗。

Q：柱子(zǐ)進氣泡或跑幹了(le)，怎麽辦？

A：可能(néng)的原因 ：環境溫度變化(huà) ；緩沖液未經過脫氣 ；層析柱連接系統或操作(zuò)不當。

建議處理(lǐ)方法 ：用大量脫氣去離子(zǐ)水或 20%乙醇反向高速沖洗層析柱，直到小氣泡被帶出 (沖洗過程建議在系統連接反壓閥之後進行) 。如(rú)果大量進氣，建議重新(xīn)裝柱。